The chemical structure and extraction process of chlorogenic acid in honeysuckle and its pharmacological effects, such as antibacterial, antiviral, antitumor and immunomodulatory, were outlined, with the aim of providing a scientific basis for the rational application of honeysuckle and an important theoretical reference for exploring its medicinal value prospects.

Keywords:Honeysuckle PE, Extraction Method, Efficacy Function, Chlorogenic Acid

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1. 引言

金銀花為忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或待初開的花，是一種常見植物物種。呈棒狀，上粗下細(xì)，略彎曲，長2~3 cm，上部直徑3 mm，下部直徑1.5 mm，表面黃白色或綠白色，密被短柔毛。金銀花亦稱二花、銀花、忍冬花等，性寒、味苦。有史以來，它一直被作為消炎解毒的藥材，有著疏散風(fēng)邪、解除表證、解毒散瘀、排膿消腫的功效，常用于中藥制劑、抗菌、抗病毒、降血糖、增強(qiáng)免疫力等方面。金銀花的化學(xué)成分按結(jié)構(gòu)分類主要包括黃酮類、有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂苷類、揮發(fā)油及多種微量元素，其提取物的成分有木犀草素、木樨草苷、綠原酸、異綠原酸等。

木犀草素是黃酮類的有效成分，具有可以抗炎、抗氧化的特性，可通過降低炎癥因子和過量活性氧對(duì)機(jī)體造成的傷害，從而維持正常的組織和細(xì)胞；保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，減少神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，改善記憶力和認(rèn)知功能；還可以通過抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增，加快代謝達(dá)到抗腫瘤作用。木樨草苷(Luteolin)具有很強(qiáng)的抗呼吸道合胞體病毒活性。

綠原酸類化合物也是金銀花提取物中有效成分之一，它包括綠原酸和異綠原酸，其中異綠原酸為一種混合物，分別為異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C。異綠原酸A和異綠原酸C可以抑制白細(xì)胞遷移和炎癥過程超氧陰離子的產(chǎn)生，具有良好的體外抗炎作用。異綠原酸B能促進(jìn)前列腺素E2的形成，其呈現(xiàn)較好的抗炎活性。綠原酸作為關(guān)鍵的有效成分，是一種具有重要臨床用途的有機(jī)酸，也是生物活性材料領(lǐng)域研究的熱門課題。除了具有醫(yī)療用途外，還廣泛應(yīng)用于食品、養(yǎng)生保健、日用化工等行業(yè)，因此有必要對(duì)綠原酸的提取進(jìn)行研究。目前，國內(nèi)外對(duì)金銀花的藥理作用以及應(yīng)用都做了大量的工作，并取得了一定的成果。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步分析和比較了從金銀花中提取綠原酸的方法，以期進(jìn)一步探討金銀花的藥用功效，為開發(fā)高效、經(jīng)濟(jì)地提取技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

2. 綠原酸的結(jié)構(gòu)

綠原酸廣泛存在于植物中，以金銀花、杜仲、青蒿等藥用植物中含量較高，具有廣泛的藥理作用。綠原酸在醫(yī)藥、日用化工、食品等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用?？茖W(xué)家Rudkin和Nelson在1947年首次確定了綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其化學(xué)式為C₁₆H₁₈O₉，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。綠原酸是酚型抗氧化劑，是酚酸類化合物的一種，由羧基和鄰二酚羥基構(gòu)成，在甲醇、乙醇、丙酮和水中具有很強(qiáng)的溶解力，所以利用該特性可以從植物中分離出綠原酸。其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的鄰苯二酚是酚酶催化最合適的反應(yīng)底物，綠原酸成分可有效防止水果發(fā)生氧化反應(yīng)，如桃子、蘋果等。綠原酸中有三種紊亂元素，即酯鍵、不飽和雙鍵、多元酚，在提取過程中，通過水解和分子內(nèi)酯基轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)異構(gòu)化，在堿性和高溫環(huán)境下可發(fā)生水解氧化為綠色醌類化合物。用于從植物中提取綠原酸的極性有機(jī)溶劑一般有乙醇、丙酮和甲醇，盡管如此，因?yàn)槠涔逃械牟环€(wěn)定因素，在提取過程中應(yīng)防止高溫狀態(tài)、強(qiáng)光照射以及持續(xù)受熱且應(yīng)貯存于陰涼處。

3. 金銀花中綠原酸的測定方法

依據(jù)2020版的《中國藥典》，金銀花主要活性成分指標(biāo)是綠原酸和酚酸類總量，綠原酸是其主要有效成分，其含量常用來作為控制金銀花的質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，它含量的多少是評(píng)判金銀花質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一，故綠原酸含量檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性尤為重要。綠原酸的檢測方法多種多樣，如分光光度法、薄層層析—紫外分光光度法、高效液相色譜法等方法，以篩選出優(yōu)質(zhì)的金銀花種質(zhì)資源，為金銀花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 1. The structure of chlorogenic acid

圖1. 綠原酸結(jié)構(gòu)

金銀花提取物11.png

3.1. 高效液相色譜法(HPLC法)

龔菊梅等[1] 采用高效液相色譜法同時(shí)測定金銀花中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸的含量，得出綠原酸、新綠原酸和異綠原酸在0.013~0.526 mg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r為0.9993)，且平均加樣回收率均 > 99%，證明了該方法可靠、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可作為金銀花中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸的含量測定方法，表明新綠原酸、綠原酸可以作為金銀花等級(jí)劃分的參考指標(biāo)。王玉潔等 [2] 以金銀花為原料，采用水浴加熱輔助提取法同步提取金銀花中的綠原酸與總黃酮，并采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定。基于單因素試驗(yàn)，以綠原酸與總黃酮含量的總評(píng)“歸一值”為因變量，利用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)液料比、提取時(shí)間、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過調(diào)整提取工藝條件，從金銀花中提取綠原酸與總黃酮的含量分別為30.79、63.35 mg/g，得率分別為3.08%和6.34%。該方法簡單、快速、靈敏，可用于金銀花中綠原酸和總黃酮含量的同時(shí)檢測。

3.2. 數(shù)碼成像比色法

數(shù)碼成像比色法是基于數(shù)碼設(shè)備上獲得的顏色數(shù)值完成定量分析的一種新方法，微流控紙芯片法是當(dāng)前微全分析系統(tǒng)發(fā)展的熱點(diǎn)，以紙張為制作材質(zhì)的紙質(zhì)微流控芯片(簡稱紙芯片)，是一種新型微尺度分析器件，利用特定材質(zhì)在紙上制作疏水邊界，將被測流體限定在預(yù)設(shè)的親水區(qū)域內(nèi)，引導(dǎo)流體流入檢測區(qū)與預(yù)加的反應(yīng)劑進(jìn)行接觸反應(yīng)。

孔京華[3] 基于數(shù)碼成像法的原理，利用綠原酸與三氯化鐵發(fā)生顯色反應(yīng)的原理，制作綠原酸快速測定紙芯片，并結(jié)合智能手機(jī)的數(shù)碼成像功能，開發(fā)的一種紙基微流控?cái)?shù)碼成像法，為綠原酸含量快速測定提供新的思路。樂薇等 [4] 基于數(shù)碼成像法，利用熒光碳點(diǎn)的高靈敏度，結(jié)合分子印跡技術(shù)的高選擇性，制備了一種快速測定綠原酸含量的微流控紙芯片。該紙芯片成本低廉、選擇性良好、檢測速度快(20 min內(nèi)可完成)，可作為測定條件簡陋、現(xiàn)場臨時(shí)快速測定綠原酸含量的補(bǔ)充方法。上述紙芯片有以下優(yōu)點(diǎn)，分析速度極快，可在數(shù)秒或數(shù)十秒時(shí)間內(nèi)自動(dòng)完成測定、分離或其他更復(fù)雜的操作，分析和分離速度比常規(guī)宏觀分析法快一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)；試樣與試劑消耗量極少，這既降低了分析費(fèi)用和貴重生物試樣的消耗，也減少了環(huán)境污染，是綠色分析技術(shù)；便攜且應(yīng)用廣泛，由于將微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和其他功能單元集成在一個(gè)幾平方厘米的芯片上，因此易制成功能齊全的便攜式儀器，用于各類現(xiàn)場分析。

傳統(tǒng)檢測所需使用到的儀器昂貴且檢測所需耗材費(fèi)用相對(duì)較高，對(duì)測定環(huán)境要求高且主要適合在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，不適于現(xiàn)場的快速檢測?；谶@些因素限制了對(duì)綠原酸的進(jìn)一步研究。目前國內(nèi)外都在不斷探索綠原酸的提取和合成方法，其成果也非常顯著，這就對(duì)綠原酸的檢測手段和方法有了更高的要求。

4. 金銀花中綠原酸的提取方法

綠原酸又稱咖啡鞣酸，具有更多的親水性基團(tuán)，因此容易溶于水和親水性有機(jī)溶劑。羥酚酸(HPA)是由奎寧酸和咖啡堿共同組成，它是有氧呼吸產(chǎn)生的苯丙素的次生代謝物。綠原酸性質(zhì)不穩(wěn)定、化學(xué)特性差、結(jié)構(gòu)式復(fù)雜等原因，致使提取工藝成為當(dāng)前的熱門研究之一。作為金銀花的主要成分，其廣泛的藥理學(xué)作用，綠原酸現(xiàn)在被廣泛用于制藥領(lǐng)域。隨著研究工作的不斷深入，對(duì)綠原酸及綠原酸衍生物的開發(fā)利用越來越多。本文就綠原酸的提取方法進(jìn)行概述供參考。

4.1. 傳統(tǒng)提取法

4.1.1. 水提法

提取溶劑中水是安全、節(jié)能又經(jīng)濟(jì)的一種，水提法是相對(duì)簡單有效的方法，以水為溶劑從植物中提取綠原酸。丁敏等[5] 通過水提回流法采用L9 (34)正交試驗(yàn)法對(duì)提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，提取率顯著高于煎煮法和超聲提取兩種提(P < 0.05)。水提法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、便捷，因?yàn)槿軇┛梢曰厥?，可以使運(yùn)營成本減少，溶劑消耗量下降，有效成分浸出完整、安全。由于提取時(shí)間較長(一般在4~5天)，使其應(yīng)用受到了一定限制。缺點(diǎn)是提取液含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、鞣質(zhì)等提取雜質(zhì)，給下一步的過濾、濃縮、純化帶來不便，提取過程耗時(shí)長，導(dǎo)致提取率低。

4.1.2. 醇提法

醇提法是最常見的綠原酸提取方法之一，綠原酸是一種酚酸類物質(zhì)，本身具有極性，可溶于醇類。乙醇回流法是目前應(yīng)用最廣泛、發(fā)展更成熟的綠原酸提取技術(shù)，具有綠原酸不易被破壞、選擇性好、溶劑回收快、提取時(shí)間短、提取液不易霉變等優(yōu)點(diǎn)，適合后續(xù)深加工，類似于水提取工藝操作安全、方便易行。劉金磊[6] 以金銀花為主要原料，70%的乙醇作為提取液，研究了溶劑、時(shí)間、濃度和pH值對(duì)綠原酸提取率的影響，以獲得最佳處理?xiàng)l件和金銀花中綠原酸的最大產(chǎn)量。王鑫等 [7] 利用乙醇溶液為提取劑，采用回流法和超聲波萃取法從金銀花中提取綠原酸，并討論了不同因素對(duì)金銀花中綠原酸提取率的作用，證明回流法的效果更好。醇提法會(huì)消耗大量的溶劑，難以濃縮，且含有大量的水溶性懸浮物，導(dǎo)致提取率低，所以此法有待于進(jìn)一步改進(jìn)。

4.2. 物理提取法

4.2.1. 超聲波輔助提取法

超聲波輔助法是指超聲波空化產(chǎn)生的強(qiáng)大機(jī)械力：微射流和沖擊波，促進(jìn)介質(zhì)分子通過細(xì)胞壁的滲透，導(dǎo)致金銀花的細(xì)胞壁破裂，使有效成分釋放出金銀花中的物質(zhì)成分溶于有機(jī)溶劑中，以更好地提高綠原酸的得取率。超聲輔助提取是一種借助于超聲波的常規(guī)提取方法，比傳統(tǒng)的水，乙醇有顯著的優(yōu)勢(shì)，與簡單的溶劑提取法相比較具有提取效率高、節(jié)省時(shí)間和效率、提取雜質(zhì)少、低溫萃取，并且成分、結(jié)構(gòu)及活性物質(zhì)不易被破壞、廣泛的適用性等優(yōu)點(diǎn)，因此，該工藝尤其適用于綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)。宋琳琳等[8] 通過單因素和正交設(shè)計(jì)對(duì)金銀花中綠原酸的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，用超聲波輔助法從液料比、乙醇濃度、溫度等方面，發(fā)現(xiàn)最佳提取條件是在40分鐘內(nèi)提取到綠原酸，得到平均提取率為8.78%。朱國建等 [9] 人采用超聲波回流法從金銀花中提取綠原酸，與回流法相比提高了7%，和超聲波法相比產(chǎn)量提高了越5%。由于噪音污染問題和超聲波的衰減系數(shù)有限，超聲波輔助提取方法只能用于物理因素穩(wěn)定的材料。此外，超聲設(shè)備的安全也難以保證，所以不能在線進(jìn)行不間斷的維護(hù)。

4.2.2. 微波輔助提取法

微波萃取法被廣泛用于熱敏性天然產(chǎn)物活性成分的萃取，利用微波的熱效應(yīng)，調(diào)整微波加熱的參數(shù)，有選擇地加熱物質(zhì)中的目標(biāo)成分，在不破壞熱穩(wěn)定性的情況下促進(jìn)物質(zhì)的擴(kuò)散和溶解。微波提取法同理超聲波提取法，其優(yōu)點(diǎn)是節(jié)能環(huán)保、產(chǎn)量高、受熱均勻、適用范圍廣、選擇性高、重現(xiàn)性好、抗生物活性和提取成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，是目前最有前途的提取方法。侯敏娜[10] 利用響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型進(jìn)行微波提取金銀花中綠原酸的研究，研究發(fā)現(xiàn)，金銀花綠原酸的實(shí)際提取率為9.77266%，與預(yù)測值9.77285%幾乎沒有差別，為優(yōu)化金銀花的微波輔助提取率和合理廣泛利用金銀花提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)依據(jù)。賀云等 [11] 利用微波輔助提取工藝的最佳條件，從金銀花渣中提取了14.24%的總黃酮，在此條件下提取的綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.98%，這也是金銀花藥渣再利用的基礎(chǔ)。然而，微波輔助提取法在樣品量和提取溶劑方面有局限性，維護(hù)成本高，存在安全隱患問題 [12]。

4.3. 其他輔助提取法

4.3.1. 超高壓提取法

超高壓提取法是一種通過在室溫下對(duì)原料溶液施加恒定的靜水壓力并保持一定時(shí)間，待內(nèi)外壓力達(dá)到平衡后突然釋放壓力，從而迅速增加細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差，將細(xì)胞內(nèi)的活性成分通過各種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外的提取物中的提取方法。葉陳麗等[13] 應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)方法，通過數(shù)學(xué)模型得出幾個(gè)變量之間的相互關(guān)系和影響因素，以優(yōu)化從金銀花中高壓提取綠原酸的最佳工藝條件。該方法作為一種提取中藥的新技術(shù)，具有能在室溫下提取、產(chǎn)量高、消耗時(shí)間短、能耗低、純度高、產(chǎn)品生物活性好等優(yōu)點(diǎn)，尋求一種快速、高效提取綠原酸的新方法。

4.3.2. 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是一種新型的化工技術(shù)，是使用超臨界流體作為提取溶劑分離提取混合物的過程。此工藝有良好的溶劑性能、滲透性強(qiáng)、密度大、溶解性好等優(yōu)點(diǎn)。超臨界流體提取方法因其較好的選擇性、環(huán)保、綠色環(huán)保，特別是消除了有機(jī)溶劑對(duì)人類健康和環(huán)境的影響，而不破壞成分或結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)[14]，多用于生物技術(shù)、制藥、食品和化妝品行業(yè)。然而，這種方法難以分離離子性化合物，不適應(yīng)用于極性大的物質(zhì)。劉川銘等 [15] 通過超臨界二氧化碳萃取技術(shù)，結(jié)合了精餾和液液萃取兩種功能的特點(diǎn)，將目標(biāo)物質(zhì)中的有效成分提取出來，其中金銀花萃取率達(dá)到2.07%，具有高產(chǎn)率、雜質(zhì)含量低、萃取耗時(shí)少以及不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)。

4.3.3. 酶解提取法

酶解法用酶的特異性破壞細(xì)胞壁，如纖維素酶和果膠酶，作為打破細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和溶解活性成分的首選酶，由于細(xì)胞壁先被打破，目標(biāo)物質(zhì)很容易從細(xì)胞壁中滲出，其提取速度可以加快，酶解法是近年來一種新的天然產(chǎn)品提取技術(shù)，細(xì)胞內(nèi)活性成分的提取應(yīng)用領(lǐng)域正在逐步擴(kuò)大。與常規(guī)提取方法比較，酶解反應(yīng)提取時(shí)間短、被提取物質(zhì)結(jié)構(gòu)不易被破壞、高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。楊紅文等[16] 利用纖維素酶法提取金銀花中綠原酸并優(yōu)化提取工藝，纖維素酶添加量0.4%、pH 4.5，此條件下綠原酸提取率為40.10 mg/g。呂欣等 [17] 采用超聲輔助酶法提取金銀花中的多糖，具有節(jié)約時(shí)間和提高多糖得率的優(yōu)點(diǎn)。劉霞等 [18] 以綠原酸提取率為考察指標(biāo)，研究了酶法輔助聚乙二醇(PEG)-200提取野菊花中綠原酸的工藝條件，其中纖維素酶用量、液固比、酶解溫度、酶解時(shí)間等條件下野菊花綠原酸提取率可達(dá)3.92%。酶法水解的優(yōu)點(diǎn)是無毒、環(huán)保，可以提高產(chǎn)率，但成本較高，提取條件有限。目前，將酶水解與其他技術(shù)相結(jié)合的工藝很少，酶的種類也非常有限，因此需要進(jìn)一步的研究。

4.3.4. 閃式提取技術(shù)

閃式提取技術(shù)是通過高速機(jī)械剪切力和超動(dòng)態(tài)分子滲透作用，在適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┲?，藥材在幾秒鐘?nèi)被磨成小顆粒的方法，并使其中的有效成分與提取溶劑充分接觸達(dá)到快速轉(zhuǎn)移目的的一項(xiàng)新的技術(shù)。何淑芬等[19] 選擇閃式提取技術(shù)，采用Box-Behnken效應(yīng)面法，通過調(diào)整乙醇濃度、原料與液體的比例以及每次提取的次數(shù)，使金銀花中綠原酸的轉(zhuǎn)移率達(dá)到92.87%。優(yōu)選的它具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、高效節(jié)能、提取方法簡便、操作易行、常溫下結(jié)構(gòu)分解小等優(yōu)點(diǎn)，可以提供快速提取金銀花藥材活性成分和質(zhì)量控制的新思路，但缺點(diǎn)是藥材粉碎后過濾繁瑣。

4.3.5. 索氏提取法

索氏提取指通過溶劑回流和虹吸原理使固體中的可溶性物質(zhì)在燒瓶中得到濃縮，從而獲得高的提取效率，這是一種被廣泛接受的從固體中提取化合物的經(jīng)典方法[20]。曹曉琴等 [21] 采用索氏提取法比酸醇提取略低，其提取液更清晰，雜質(zhì)更少，更容易分離和提純，這種方法更容易操作，成本更低，該工藝可實(shí)現(xiàn)金銀花的工業(yè)化生產(chǎn)，為金銀花有效成分的工業(yè)化提取提供技術(shù)參考。兼具提取率高、提取雜質(zhì)少的優(yōu)勢(shì)，而傳統(tǒng)的索氏提取法存在回收率低、重現(xiàn)性差、污染嚴(yán)重等問題。

參考文檔：

雷濱瑜¹，楊雅茹^2*，閔清¹，胡文祥^1,3*

●How to Cite this Article

¹湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧

²解放軍總醫(yī)院京北醫(yī)療區(qū)，北京

³北京神劍天軍醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院京東祥鵠微波化學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京